Цель: изучить основы нефелометрии и турбидиметрии

 

План:

​1. Рассеяние света. 

2. Нефелометрия

3. Турбидиметрия

 

1. Рассеяние света

Мутный раствор в кювете

• поглощает свет (если окрашен)

• частично проходит, не изменяя направления (трансмиссия)

• частично рассеивается, изменяя направление под различными углами (рассеивание)

Трансмиссия и рассеивание зависят от

• длины волны светового потока

• частоты светового потока

• интенсивности светового потока

• свойств рассеивающей среды (размера и формы частиц, количества, способности к поляризации и др)

Если в процессе измерения размер частиц в растворе меняется, будет меняться поток проходящего и рассеивающего света

Определение светорассеивания зависит от:

•длины волны (λ)

•диаметра частиц, на которых происходит рассеивание

Если размер частиц значительно меньше длины волны светового потока (<λ/10) – упругое рассеяние

Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению Релея

​

​

​

Ir и I0 – интенсивность рассеянного и падающего света, n1 и n – коэффициенты преломления частиц и среды, N – общее число частиц, V – объем частиц, λ – длина волны падающего света, d – расстояние до наблюдателя, β  –  угол, образованный падающим и рассеянным светом

При лабораторных исследованиях величины V, n1, n, λ, d и β – известны и постоянны для исследуемого

вещества, N = С*b. С – концентрация вещества, b – толщина раствора.

Для определенного угла формула принимает вид:

​

​

​

Известные параметры объединены в коэффициент k

В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракции

•Рассеяние света каждой частицей не зависит друг от друга.

•Рассеянный свет распространяется во всех направлениях

•Максимальное количество света рассеивается под углом 0 и 180º

​

​

​

​

•При λ 400нм – такой тип рассеивания характерен для частиц диаметром  < 40 нм (иммуноглобулины,β- липопротеины, альбумин)

При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричным

 

 

​

​

•Максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча

•При λ 400нм (Ig M, хиломикроны, формирующиеся комплексы антигенов с иммуноглобулинами)

При превышении длины света  (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличивается

•Характерен для взвеси бактерий, клеток крови (тромбоциты, эритроциты)

​

​

​

2. Нефелометрия

•Измерение рассеянного света

•Сравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию вещества в растворе

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

А – нефелометр, регистрирующий малоугловое рассеяние

Б- нефелометр, регистрирующий рассеяние под углом 90º

​

Оптическая схема нефелометра

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

1 – лампа, 2,11 – светофильтры; 3 – стеклянная пластинка, разделяющая свет на 2 пучка; 4 – кювета с исследуемым раствором; 5 – ловушка света; 7, 8, 9 – линзы; 8 – уравнительные диафрагмы; 10 – ромбические призмы; 12 - окуляр

Свет разделяется на 2 пучка – один проходит черезраствор исследуемого вещества, другой – через канал сравнения

Источник света – лампы или лазерные источники излучения (высокая интенсивность излучения, строгая направленность, строгая фиксированная длина волны – идеален для нефелометрии)

​

3. Турбидиметрия

•Измерение прошедшего света

•Турбидиметры построены по типу фотометров

​

​

​

​

​

​

​

 

Интенсивность прошедшего светового потока определяется уравнением

​

​

​

​

I0 – интенсивность падающего света

It – интенсивность потока, прошедшего через раствор

С – концентрация рассеивающих частиц

B – толщина поглощающего слоя

d – средний диаметр рассеивающих частиц

k и α – константы, зависящие от природы вещества и метода измерения

λ- длина волны

При постоянных b, d, k, α и λ получим

​

​

​

Выражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворов

•t – молярный коэффициент мутности раствора (турбидность)

•В качестве турбидиметров можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов

•Обычно используются короткие волны (340 нм), т.к. доля рассеянного света увеличивается обратно пропорционально четвертой степени длины волны – т.е. при меньшей длине волны прошедший свет будет составлять большую часть от падающего, для более короткого ультрафиолета нужна специальная оптика

Турбидиметрия и нефелометрия

•Используются для определения индивидуальных белков

•Особенность – построение калибровочного графика с использованием не менее пяти концентраций (калибровочный график имеет нелинейный характер)

Кривая доза-эффект

•При взаимодействии антиген-антитело образуют агрегаты

​

​

 

​

При постоянной концентрации антител при невысокой концентрации антигена все антигена связываются с антителами. При осаждении  комплексов центрифугированием – в супернатанте – несвязанные антитела – избыток антител. Преципитат не образуется

•При пропорциональной концентрации антигенов и антител комплекс выпадает в осадок – преципитат. В супернатанте не определяются антитела и антигены – эквивалентное состояние

​

​

​

​

•При увеличении концентрации антигенов количество антител недостаточно для полного связывания белка.

​

​

​

​

•Частицы иммунных комплексов становятся мелкими, преципитат не формируется. В супернатанте – свободные антигены – антиген-эксцесс

1) Зона избытка антител – величина преципитатов увеличивается по мере добавления антигенов. В супернатанте свободные антитела

2) Зона соответствия антигена и антитела –максимальная препитация. В супернатанте нет свободных антител и антигенов

3) Зона избытка антигенов. Формирование небольших иммунных комплексов, а не преципитат. В супернатанте – свободные антигены

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Классическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля

​

Калибровочный график строится для

-каждого индивидуального белка

-каждого прибора

-при любом условий регистрации

-периодически при проведении исследований

При серийных исследованиях в стандартных условиях допускается корректировка графика на основании

измерения одного из стандартов. (вид стандартной кривой не меняется из-за влияния систематических факторов, происходит параллельный сдвиг всего графика)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

​

Для построения графика требуется по крайней мере 5 стандартных растворов

​

•Состав реакционной смеси подбирается так, чтобы измерение производилось в зоне избытка антител.

•При очень высокой концентрации белка антител недостаточно, частицы преципитата становятся мелкими (нисходящая часть кривой) – с увеличением концентрации белка сигнал прибора уменьшается. Может быть выдан неправильный результат.

•Проводят разведение биологической жидкости

•Если сигнал увеличивается – определение проводилось в нисходящей части кривой

•Разведение проводят до степени избытка антител

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

1- если после добавления антигена реакция ускоряется, имеет место избыток антител (измерение проводится правильно)

2- если после добавления антигена реакция не ускоряется, имеет место избыток антигена (измерение проводится неверно)

Клинический спектрофотометр 

​

​

​

​

​

​

​

 

Спектрофотометр без монохроматора

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

 

 

 

 

 

​

Кормей-мульти – программируемый фотометр с проточной кюветой

 

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

Контрольные вопросы:

​

1. Какому уравнению подчиняется интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами?

2. Особенность турбидиметрии и нефелометрии?

3. В какой зоне величина преципитатов увеличивается по мере добавления антигенов?

4. Опишите оптическую схему нефелометра

5. При каких условиях рассеивание становится несимметричным?